Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated

 重組霍亂毒素B亞基（CF488A標記，綠色熒光）

產(chǎn)品信息

背景描述

霍亂毒素（Cholera toxin，CTX）是霍亂弧菌產(chǎn)生的毒力因子，會引起嚴重腹瀉以及人體脫水。CTX屬于AB5亞基家族。天然六聚體蛋白含兩個亞基，分子量約85kDa。由一個A亞基（約27.2kDa）和五個B亞基（約11.6kDa/亞基）組成，B亞基以五聚體環(huán)的方式排列，呈明顯的五度對稱，負責毒素識別并吸附細胞表面的神經(jīng)jie苷脂GM1。A亞基催化刺激性G蛋白α亞基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亞基。Gαs的活化引起腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性增加，進而促使cAMP水平提高。A亞基還能ADP核糖基化視桿細胞外節(jié)膜盤的轉運蛋白，使得GTPase失活。霍亂毒素還是一種高效的黏膜疫苗佐劑，通過抑制IL-12生產(chǎn)來誘導2型輔助性T細胞的免疫應答。

霍亂毒素B亞基（CTB）對細胞無毒，本質(zhì)上不含腺苷酸環(huán)化酶活性。CTB通過結合神經(jīng)jie苷脂GM1附著到細胞上，是小膠質(zhì)細胞的良好標記物（這類細胞表面富含神經(jīng)jie苷脂GM1），但不適合標記少突膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞。CTB是利用組化方法研究軸突運輸?shù)膬?yōu)秀示蹤劑。CTB也是常用的脂筏標記物，脂筏是富含膽gu醇和鞘脂的膜微區(qū)，在細胞信號轉導和蛋白質(zhì)運輸中發(fā)揮重要作用。

產(chǎn)品描述

本品是偶聯(lián)上綠色熒光素-CF488A（Ex/Em=490/515nm）的重組霍亂毒素B亞基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated，簡寫：CF488A conjugated- rCTB，適用于神經(jīng)學研究中的束路追蹤，靶向神經(jīng)jie苷脂GM1）結合和逆行運輸。也可在活細胞或固定細胞成像中用作脂筏標記物和內(nèi)吞示蹤劑。

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，至少6個月有效。

運輸：冰袋運輸。

產(chǎn)品特性

1） 同義名：Choleragenoid; CTB; CTxB；霍亂毒素B亞單位；

2） 來源：大腸桿菌

3） 登錄號：P01556

4） 分子量：~11.6kDa（含103個氨基酸的單一非糖基化肽鏈，Thr22-Asn124）

5） 純度：≥98%（SDS-PAGE）

6） 外觀：無色溶液（溶于5mM PB, pH7.0, 75mM NaCl, 50% glycerol，經(jīng)0.2μm濾膜過濾除菌）

7） 內(nèi)毒素：≤0.1 EU/µg（LAL method）

注意事項

1） 本品以凍干粉形式提供，由于量比較少，初次使用前需置于室溫回溫至少30min，低速離心后，再開蓋直接往瓶內(nèi)加入合適的溶劑進行溶解。

2） CF系列熒光染料是Biotium的注冊商標，Alexa Fluor和DyLight系列染料是Thermo Fisher的注冊商標，Cy系列染料是Cytiva的注冊商標。

3） 本品僅供科研用途，絕不可以用于臨床或診療用途。

4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

以下是用熒光標記的rCTB對細胞進行標記的實驗流程。對于其他的應用（比如：神經(jīng)示蹤），請根據(jù)應用查找相應的文獻作為參考。

一、 自行準備材料

1.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）（比如：MS3552-500ML）

1.2 牛血清白蛋白（BSA）（比如：MP6101-5G）

1.3 HBSS（比如：MS3505-500ML）

1.4 4%多聚甲醛（比如：MM1504-500ML）

1.5 【可選】Hoehcst 33342（比如：MX4203-10MG，MX4203-1ML，MX4204-10ML）

二、 染料準備

重溶：將低溫保存的CF488A conjugated- rCTB（規(guī)格：100μg）置于室溫回溫至少30min，低速離心3-5min，將粉末離心至管底。直接往瓶子加入100μl無菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。

保存：新鮮制備的CF488A conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3個月穩(wěn)定。亦可根據(jù)單次用量分裝后，置于-20℃避光保存，6個月穩(wěn)定，避免反復凍融。

三、 活細胞的表面標記

3.1用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA清洗細胞一次；

3.2用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA稀釋CF488A conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作濃度：400ng/ml-1μg/ml。

3.3吸走細胞內(nèi)的緩沖液，加入新鮮配置的CF488A conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。

3.4用4℃預冷的HBSS+0.5% BSA清洗細胞三次；

3.5用4%多聚甲醛固定細胞，+4℃避光固定15min。

3.6用PBS清洗細胞二次，之后進行成像或接著做后續(xù)的染色。【注：根據(jù)實驗需求，考慮是否加入核復染劑-Hoechst 33342等】

應用實例（來自文獻，僅做參考）

Ref1）Arachchige SP, Henke W, Kalamvoki M, Stephens EB. Structural Domains of the Herpes Simplex Type 1 gD Protein that Restrict HIV-1 Particle Infectivity. J Virol. 2021 Mar 25;95(8):e02355-20. doi: 10.1128/JVI.02355-20. Epub 2021 Feb 3. PMID: 33536165; PMCID: PMC8103709.

實驗目的：脂筏鑒定（Identification of lipid rafts）

實驗方法：COS-7細胞（轉染pcDNA3.1或pcDNA3.1(+)-HSV-1 gD）于37℃培養(yǎng)24h。吸走培養(yǎng)基，用HBSS-BSA清洗，加入CF488A標記的霍亂毒素B亞基（1μg/ml）于冰上孵育30min。細胞用HBSS-BSA和PBS清洗。用4%多聚甲醛固定15min，用PBS清洗，之后用含5%BSA的PBS孵育1h。為了共定位gD和GM1，用小鼠抗gD的單克隆抗體室溫孵育1h。載玻片用PBS清洗后，用Aleca Fluor 594標記的兔抗小鼠IgG孵育1h，之后用DAPI（1μg/ml）復染5min。蓋玻片清洗后用含甘油的封片劑封片。CF488A標記的霍亂毒素B亞基用FITC濾片觀察，HSV-1 gD用Alexa 594抗體染色用Texas Red濾片觀察。

實驗圖片：

Fig.Expression of gD results in colocalization with ganglioside GM1. COS-7 cells were transfected with a vector expressing gD for 48 h, and cells were reacted with cholera toxin subunit B (CTB) tagged with Alexa Fluor 488. The cells were fixed (but not permeabilized) and reacted with a mouse monoclonal antibody against gD, then washed and reacted with a secondary goat anti-mouse monoclonal antibody tagged with Alexa Fluor 594. Cells were once again washed, mounted, and examined using a Leica TCS SPE confocal microscope with a 63×objective with a 2×digital zoom and the Leica Application Suite X (LAS X) software package. A 405-nm filter was used to visualize DAPI, a 488-nm filter was used to visualize CTB, and a 594-nm filter was used to visualize gD staining.

Ref2）Yasuda M, Nagappan-Chettiar S, Johnson-Venkatesh EM, Umemori H. An activity-dependent determinant of synapse elimination in the mammalian brain. Neuron. 2021 Apr 21;109(8):1333-1349.e6. doi: 10.1016/j.neuron.2021.03.006. Epub 2021 Mar 25. PMID: 33770504; PMCID: PMC8068677.

實驗目的：視網(wǎng)膜膝狀體投射的順行標記

實驗方法：小動物麻醉后，眼內(nèi)注射CF594或CF標記的霍亂毒素B亞基（CTB,1mg/ml in PBS）進入眼內(nèi)標記P2或P14位的RGC軸突。CTB注射后24h（P3或P15），小鼠經(jīng)心臟灌流PBS，之后灌注4%多聚甲醛（PBS）。摘除大腦和眼睛，之后置于4%多聚甲醛（PBS）固定過夜，進行后續(xù)分析。

示例圖片：

Fig 2(J–N) JAK2 activation promotes eye-specific segregation. (J) Schematic diagram of RGC projections to the dLGN, labeled with CTB (CF594 = green; CF660R = pink). Chx10-Cre;SOCS3fl/fl (SOCS3 KORGC) mice received intraocular injections of CTB at P14. dLGNs were analyzed at P15. (K) Projection patterns of Control and SOCS3 KORGC RGC axons to the dLGN.“Overlap"shows the overlapped region between CTB594 and CTB660R signals (5% intensity threshold).

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